Молекулярно-генетическая экспертиза: как ловят маньяков в XXI веке
Когда в XIX веке было выяснено, что папиллярный узор на подушечках пальцев уникален для каждого индивида, дактилоскопия революционизировала криминалистику. Оставил отпечаток на месте преступления – не отвертишься. Преступники вооружились перчатками и салфетками для стирания «пальчиков». Но им стало гораздо сложнее, когда было сделано новое открытие: наш индивидуальный «паспорт» хранится в каждой из ста триллионов клеток человеческого тела.
Да, речь идет о ДНК и молекулярно-генетической экспертизе. Всё вроде бы просто: берется ДНК из клеток, оставленных преступником, и сравнивается с ДНК из клеток подозреваемого. На самом деле, конечно, простота тут кажущаяся. Если некоторые живые клетки можно разглядеть в слабенький школьный микроскоп, а то и невооруженным глазом (пример — яйцо), то ДНК — объект микромира, и так просто «взять» ее не получится. То же со «сравнением». ДНК человека составляют 3,1 млрд пар оснований. Прочтение (секвенирование) всего этого объема информации — задача крайне трудоемкая.
Сколько надо клеток?
О том, как составляется уникальный генетический портрет человека и какие технологии при этом применяются, мы поговорили с представителями компании Gordiz — единственного в России производителя реагентов для проведения генетических судебно-медицинских экспертиз. Для начала хотелось узнать, какой минимум биологического материала должен оставить преступник на месте преступления, чтобы молекулярно-генетический анализ стал возможен.
Схема полимеразной цепной реакции показывает основные этапы многократного копирования интересующего участка ДНК (маркера). На этапе денатурации под воздействием нагрева цепочка ДНК распадается на две нити. На этапе отжига при охлаждении к отдельным нитям ДНК присоединяются метки-праймеры. На этапе элонгации фермент полимераза достраивает вторую нить исследуемому участку.
«Можно в принципе получить результат из одной клетки, — говорит специалист компании Сергей Леонов, врач-биохимик, несколько лет проработавший судмедэкспертом. — Есть, например, приборы — лазерные микродиссекторы, которые позволяют вырезать из исследуемых образцов единичные клетки. Однако работа с таким малым количеством генетического материала не относится к стандартным технологиям и процессам и не гарантирует высокую надежность. Для нормального процесса нужно как минимум 10−15 клеток, и на самом деле это очень маленькое количество. Одно прикосновение рукой к предмету оставляет на нем сотни клеток».
Да, человек щедро разбрасывается генетическим материалом, но уже на этапе поиска биологических следов преступника судмедэкспертов поджидает много проблем. Например, отличный материал для исследования — кровь, следы которой хорошо заметны и в них обычно много ДНК. Но в пятне крови могли смешаться кровь преступника и жертвы. Как отделить клетки друг от друга? Задача несколько упрощается, если преступник и жертва разнополы: тогда возможна предварительная сортировка по наличию или отсутствию Y-хромосомы. Вообще работа со смешанными объектами — это часто встречающаяся ситуация: как правило, предметы, к которым прикасался злоумышленник, трогал кто-то и до него, и там можно найти биоматериал, принадлежащий десяткам людей. Для выделения нужного материала порой используют количественный метод: след преступника самый свежий, а значит, если количество каких-то клеток на поверхности объекта хотя бы на порядок превышает число остальных, можно предположить, что это и есть искомый биоматериал.
Типичный случай: после изнасилования эпителиальные клетки жертвы смешаны со сперматозоидами преступника. Для этого случая создан специальный метод. Поскольку эпителий имеет меньшую структурную прочность по сравнению с мужскими половыми клетками, его можно разрушить специальными химикатами, оставив сперматозоиды невредимыми и получив чистую фракцию клеток насильника.
Таким образом, собственно молекулярно-генетическому исследованию предшествует поиск необходимого материала и выделение его из разных смесей. Существуют, например, химические методы поиска следов крови там, где эти следы пытались отмыть. Есть технологии поиска клеток, оставленных на бумаге и других материалах.
Отмывание ДНК
Другой вопрос — сохранность биоматериала. С одной стороны, прочитан геном неандертальца и мамонта, то есть ДНК может сохраняться десятки тысяч лет. А с другой — в пятне крови, оставленном преступником пару дней назад, ДНК может не оказаться вовсе. Как же так? «ДНК — это одна из самых устойчивых биомолекул, — объясняет Сергей Леонов. — Если есть условия для хранения, она может оставаться в целости почти неограниченное количество времени. Лучшие условия — это высушивание, например на бумаге. Лично мне приходилось участвовать в работах по идентификации останков солдат, погибших во время Великой Отечественной. ДНК, обнаруженные в останках, сравнивались с сохранившимися образцами ДНК с фронтовых писем, которые предоставляли родственники погибших в этих местах воинов».
ДНК быстро разрушается под воздействием разных биологических, химических и физических факторов. Если биоматериал попадает во влажную среду, тут же начинается гниение. Гниение — это не что иное, как поедание клеток бактериями. Бактерии к тому же выделяют особые вещества — нуклеазы, которые разрушают весь находящийся поблизости генный материал: это оружие борьбы с вирусами. Если платок с пятном крови стал объектом гнилостных процессов, может оказаться, что пятно крови есть, а ДНК в нем уже нет. Наличие и концентрация в образцах генного материала будут выявлены химическими методами в ходе химического анализа, однако до того, как это произойдет, необходимо экстрагировать ДНК из клеточной среды. «Для этого, — говорит Сергей Леонов, — применяются специальные реагенты, которые полностью разрушают материал клетки, оставляя лишь ДНК. Затем ДНК электростатически связывается с сорбентом, который извлекается, а затем смывается водой. Так получается чистый водный раствор ДНК». Если согласно дальнейшему анализу генный материал есть в растворе и в требуемом количестве, можно приступать к созданию генетического «отпечатка».
На схеме показана классическая схема генетического анализа с использованием агарозного геля. Маркеры двигаются под воздействием электрического поля в блоке геля. Поскольку маркеры меньшего размера встречают меньшее сопротивление геля, они вырываются вперед. Окончательная идентификация маркеров происходит с помощью лазерной подсветки, возбуждающей флюоресценцию.
Польза от молчания
Первым делом следует заметить, что сравнивать полностью две ДНК никакой нужды нет. Генетически все люди на Земле идентичны на 99,99%, и потому есть смысл анализировать лишь сходство-различие определенных участков генома, которые обладают полиморфизмом, то есть представлены у разных людей в нескольких разных видах. «Золотым стандартом» на сегодняшний день считается исследование полиморфных маркеров, имеющих переменную длину. Маркеры — это участки «молчащей» ДНК, которые не выступают в качестве действующих генов и не кодируют белки. Зато они имеют характерную структуру — одни и те же последовательности пар оснований повторяются в них несколько раз. Разное число повторов и формирует тот самый полиморфизм. Разумеется, число вариантов длины одного маркера не равно числу людей на Земле. Если у маркера есть (условно) десять вариантов, то обладание маркером определенной длины означает лишь принадлежность к одной из десяти групп человечества, численностью в сотни миллионов человек каждая. Но если мы добавим сюда данные по второму полиморфному маркеру, группа, где встречается такое сочетание длин, заметно сузится. Речь пойдет уже о миллионах человек. При добавлении новых маркеров будет, как говорят в науке, экспоненциально нарастать дискриминационный потенциал, и наконец, число маркеров можно довести до такого количества, когда сочетание данных по их длинам станет уникальным для отдельной личности, а вероятность повтора этого «рисунка» практически сведется к нулю. Ключ к идентификации личности — всего-то дюжина полиморфных маркеров. Но тут мы вспомним, что ДНК — объект микромира, и ни линейкой, ни штангенциркулем ее участки померить невозможно. Здесь на помощь приходит биохимия и электричество.
Конструктивный бульон
Молекулы, даже такие сложные, как цепочки ДНК, настолько малы, что для молекулярно-генетического исследования требуется не одна копия интересующего нас участка генома (маркер), и не десять, и не сто, а миллионы и миллиарды. Требуется, таким образом, значительная концентрация копий маркеров, которая сделает возможным физическую индикацию параметров. Ядро, самый сложный момент всей технологии идентификации личности — полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая как раз и позволяет накопировать маркеров столько, сколько нужно. Реакция происходит в растворе, где присутствуют исследуемые ДНК, своеобразные метки-праймеры (фактически конструктивно идентичные небольшим участкам одной нити ДНК), находящиеся в «свободном плавании» формирующие ДНК азотистые основания — аденин (A), гуанин (G), цитозин ©, тимин (T), катализаторы и, наконец, главный действующий персонаж — фермент Taq-полимераза. Реакция происходит при переменных температурных режимах. Сначала с помощью нагрева ДНК денатурируется, то есть ее «двойная спираль» распадается на две нити, а пары оснований размыкаются. Затем при охлаждении праймеры отмечают границы интересующего нас маркера. Они примыкают к нитям ДНК, на небольшом участке как бы восстанавливая двойную структуру молекулы. После этого полимераза «берет» из раствора азотистые основания и, работая по одну сторону маркера, достраивает вторую нить для каждой из нитей денатурированной ДНК. В итоге вместо одной ДНК в растворе появляются две молекулы с частично восстановленной двойной структурой (в частности, для маркера). Затем все повторяется: денатурация с разделением двух нитей, праймеры и работа полимеразы. В результате цепной реакции мы получаем огромное количество копий имеющего нормальную двойную структуру маркера.
«ПЦР — очень сложный и дорогостоящий процесс, — говорит гендиректор компании Gordiz Владимир Орехов. — Количество компаний в мире, которые выпускают реагенты для такой реакции, можно посчитать на пальцах одной руки, и одна из них — наша — находится в России. Главная сложность в том, что в пробирке одновременно должны копироваться все маркеры и при этом не мешать друг другу. Сколько нужно маркеров? Американский стандарт CODIS включает в себя 13, европейский ESS — 12. Хотя маркеры из двух систем пересекаются, есть и отличия. Чтобы удовлетворить нужды специалистов, работающих в рамках разных стандартов, мы выпускаем реагенты для ПЦР с участием 19 маркеров. Такого количества хватит для идентификации уникальной личности, даже если население Земли вырастет на несколько порядков. Есть у нас и свое ноу-хау. Дело в том, что обычно реагенты для ПЦР выпускаются в жидком виде, что предъявляет особые требования к условиям хранения и транспортировки (в частности, нужна заморозка). Мы производим реагенты методом высушивания сырых смесей, и никаких особых условий для транспортировки им не нужно. Все это удешевляет процесс и упрощает задачу доставки реагентов, например, в отдаленные районы. Отмечу, что все сырье для реагентов отечественного производства».
Генетический анализатор — это аппарат, представляющий более продвинутую технологию сортировки выделенных из ДНК маркеров. Здесь маркеры двигаются в капиллярах из пористого полимера. На фото представлен прибор «НАНОФОР-05», выпущенный российской компанией «Синтол».
Гонки в поле
Продукт ПЦР — раствор с высокой концентрацией маркеров — это уже готовая база для проведения замеров. Методики могут несколько отличаться, но в основе их лежит процесс, знакомый многим, кто посещал кабинеты физиотерапии в поликлиниках. Это электрофорез — движение заряженных молекул в электрическом поле.
«До сих пор в России пользуются методом разделения продукта ПЦР на полиакриламидном геле, — рассказывает Сергей Леонов. — На смену этому методу, который берет начало с 1980-х, пришли генетические анализаторы. В них движение молекул происходит внутри капилляров из пористого полимера. Но суть одна: маркер, являясь катионом, при приложении электрического поля начинает двигаться, однако из-за сопротивления среды более длинная молекула тормозит, а короткая передвигается быстрее».
Таким образом, молекулы сепарируются по длине. Правда, некоторые маркеры могут иметь одинаковую длину (одинаковое число пар оснований), различаясь при этом по структуре размещения оснований. Чтобы избежать путаницы, потенциально схожие по размерам маркеры еще в процессе ПЦР получают флюоресцентную метку (одного из четырех или пяти цветов). В генетическом анализаторе маркеры подсвечиваются лазером, луч которого возбуждает свечение определенного цвета. После этого маркер может считаться окончательно идентифицированным. Итоговый документ анализатора — таблица, в которой цветом отмечено наличие в геноме тех или иных вариантов (аллелей) всех исследуемых маркеров. И это все?
Без свидетелей
«Нет, не все, — говорит Владимир Орехов. — Если совпадают образцы следа и живой ткани, возникает вопрос статистики — насколько вероятно совпадение. Теоретически вероятность существует, и по итогам молекулярно-генетических исследований вероятность 100% не выдается. Другое дело, что вероятность точной идентификации составляет 99% плюс много цифр после запятой. Но чтобы заключение имело все признаки научности, эту вероятность надо посчитать математически с учетом, например, популяционных частот для каждого признака (распространенный признак — больше вероятность совпадения, редкий — меньше). В связи с этим существует миф о том, что какие-то виды криминалистических экспертиз дают однозначный ответ "да" или "нет", а генетическая экспертиза дает лишь количественную оценку вероятности. Но на самом деле самый точный ответ дает именно генетика, а, например, почерковедение или дактилоскопия могут ошибаться, и такие случаи известны. Конечно, в генетическую экспертизу может вмешаться человеческий фактор (лаборант перепутал образец и т. п.), но если исследование проведено правильно, оно дает строго научный и точный результат».
С течением времени молекулярно-генетическая экспертиза становится все более распространенным и все менее дорогим методом криминалистики. При этом эффективность ее крайне высока. С 1990-х годов в США, Германии, Великобритании действуют законы о геномной регистрации. Согласно этим нормативным актам исследуется и заносится в базу данных биологический материал, оставленный на месте преступления не установленными лицами. В эту же базу заносится генный «паспорт» людей, отбывающих наказание за особо тяжкие преступления. Такая база оказалась весьма эффективным средством раскрытия преступлений, в которых нет ни подозреваемых, ни свидетелей, так как в большом количестве случаев неопознанный генетический материал рано или поздно находил посредством базы своего хозяина или показывал связь с другими совершенными преступлениями. Такой закон принят в 2009 году и в России, однако финансирование его началось лишь недавно, и говорить о серьезном эффекте для нашей страны пока преждевременно.
